資　　料


獣医疫学におけるコホート研究の理論とその応用
―BSE対策を例にとって―

門平睦代（名古屋大学農学国際教育協力研究センター助教授）


　は　じ　め　に
　

　英国における牛海綿状脳症（Bovine Spongiform Encephalopathy：BSE）の原因究明には，従来の病理組織学的検査だけではなく，疫学調査が重要な役割を果たした［4］．現在，日本で発生したBSE対策として，と畜場の全頭調査の評価と今後の対応，死亡牛の検査の取り組み，そして発生農家の同居牛を含む疫学データなどをどのように機能的に収集解析するかが大きな問題となっている．リスクアセスメントに基づくマネージメントとコミュニケーションを機能させ，消費者や生産者の安心感を取り戻すためには，疫学手法を駆使しBSE発生の因果関係を解明することが焦眉の課題であろう．
　疫学の研究方法は，観察研究と介入研究の2つに大別できる．観察研究には，患畜対照，コホート，横断研究の3つの研究方法がある．それぞれの研究方法には長所と短所があり，目的にあった研究方法を選択することが重要である．このうち，コホート研究では，たとえば，喫煙の健康に及ぼす影響を調べるために，タバコを吸う人のグループ（暴露群）と吸わないグループ（非暴露群）を数年追跡調査し，疾病の発生状況を記録し，どのような疾病が喫煙と関連するのか調べるなど患畜発生頻度を直接測定できるので，因果関係究明の点では他の研究方法より優れている［8］．本稿では，まず，コホート研究の基礎的概念について述べ，事例を用いながらBSE対策応用への可能性について解説する．

　 1．コホートとコホート研究の基礎知識

　コホートとは，ラテン語で古代ローマの歩兵隊（300〜600人よりなる）という意味を持つが，医学上で特定の期間に出生した人や動物の集団や，ある生存期間にある因子に暴露された人や動物の集団であり，自然現象や社会的効果を研究するために使われる群のことである．いっぽう，コホート研究とは，目標疾病，あるいは結果の発生に影響を与えると仮定された因子に対して，暴露を受けているかいないか，あるいは将来暴露を受けるか受けないか，また暴露の程度別に区分した一定集団を設定し実施する疫学研究方法である［5］．前向き研究（prospective study）や縦断研究（longitudinal study）とも呼ばれるように，数100頭以上の大規模な集団と，少なくとも数カ月から数年の長い観察期間を必要とする．
　コホート研究の基本的な手法と目的とは，図に示したように，研究対象とした疾病に罹っていない動物群を，原因と考えられる因子に暴露された動物群（A）と暴露されなかった動物群（B）2つのタイプのグループにわけ，一定の期間追跡し，臨床症状の発現や抗体価の上昇から，研究対象である疾病の罹患・発生率をもとめて，これらの発生率を比較することである．もし，2つのグループの発生率に統計学的有意差があれば，この原因と考えられた因子が，疾病を起こさせた原因因子であると結論づけられる．

図　コホート研究の基本的手法

　 1）コホート研究の長所と短所
　コホート研究を実施する利点とは，疾病が発生するという過程についての情報が，原因暴露から時間を追い疾病の発生まで確実に得られるので，因果関係を解き明かすために最適な方法であり，また，フォローアップ期間に疾病発生関連情報を記録することにより，多くの疾病を同時に研究できることである．
　しかし，サンプルの多さと長期間に及ぶ調査が必要であるので経費と時間がかかり，潜伏期間が長い疾病や稀にしか起こらない疾病調査には適さない．また，研究対象として調査されているという飼い主の意識が偏りを起こし，危険因子に暴露されているという度合いが変わる可能性もある．さらに，逃亡したり死亡するなど途中で研究対象より除外される個体が数多く現われたり，たったひとつの危険因子が研究の対象であるので，仮説が間違っていた場合には，期待した成果がまったく得られないなどの短所がある．
　 2）多様性のあるコホート研究手法
　上記の基本手法の他にも，以下に記載したように，コホート研究にはさまざまな実施方法がある．目的と現場の状況により適切な方法を使用することが重要で，コホート研究の短所を補ったり，経費節約の上でも利点がある［8］．
(1) 暴露された動物群と身近にいる動物だけではなく，他の地域や全国から無作為に選ばれた動物を暴露されなかった群として使うこともできる．
(2) 1回だけのベースラインサンプルを使い，暴露群と非暴露群を定義する．たとえば，全国レベルのリストから無作為サンプル抽出方法を使い，研究対象動物を選び，2つの群に配分する方法である．
(3) 罹患率ではなく死亡率を記録し，原因と死亡についての関係を研究することもできる．
(4) 国全体を対象とするような規模が大きい研究では，わざわざ新たなデータを入手するのではなく，大学附属家畜病院や開業医院の，入退院記録や市町村の死亡統計など，既存の数値を使うことができる．
(5) 過去のデータを使うタイプの，後ろ向きコホート研究もある．
(6) 暴露群と非暴露群など1対1ではなく，複数の群を使っての比較も可能である．
(7) コホート研究を利用した患畜対照研究があり，これはコホート研究の過程で発生した症例とコホート全体から抽出した対照を用いて患畜対照研究を実施することにより費用を節約することができ，調査の精度も維持できる．
　 3）コホート研究を実施する上での注意点
　以下の3つの点について研究開始時と分析時に注意を払う必要がある．
　フォーローアップ期間：同時点から始まり，同じ期間調査する研究は固定コホートと呼ばれ，分析も比較的簡単である．しかし，調査対象個体への暴露量がフォーロアップ期間中に変わったり，調査期間が違う個体も存在する変動コホートもある．固定コホートでは基本的には相対危険比（RR）を使い分析を行うが，RRでは短・長期の時間的効果を区別できないなどの問題がある．このような場合は，分析にサバイバル分析方法を使う．
　研究対象動物としての資格喪失：研究途中で死亡したり，廃棄処分されたり，売られた動物などが出ると，研究対象から除外しなければならない．この理由が疾病や事象と関連していると分析結果に問題が出るし，あまり数が多いと結果に影響を与える．
　疾病罹患の定義：研究開始時に，罹患の定義を定めておくことが肝心である．たとえば，最初の抗体調査で陰性である動物を数カ月から数年追跡し，抗体調査を毎月実施するなど，抗体価が陽性になった時が罹患した時であると定義することもできる．他の疾病では，毎週，臨床症状や抗体陽転状況を確認するなど，検査の頻度が変わる場合もある．
　 4）コホート研究でよく用いられる統計分析方法
　コホート研究の基本統計分析方法は，表のようにRRを求める方法である．カイ2乗（χ2）検定で疾病と因子の統計学的相関が認められ（P＜0.05），RRが17と，この数値が1以上であれば関連の強さが示され，因果関係があると推定できる．つまり，この例の場合では，因子を持つ動物は，因子を持たない動物より17倍も疾病に罹患する危険が高いといえる．
　もし，完全なる基本型コホート研究であれば，観察は同時期に開始され，対象から除外される動物も途中で加えられる動物もなく，固定コホートのまま一定期間経過した後，罹患動物数が観察されたということになる．
　 しかし，疑われる原因がひとつではない場合が多いので，サバイバル分析手法など，統計学的手法を用いて，多数の因子と疾病発生について分析する必要がある．以下に，代表的な手法を簡潔に紹介する．

　(1) 生　命　表
　特定年次の年齢別死亡率が将来いつまでも継続すると仮定したとき，生まれたものが死亡して減少する過程を示すもので，生存，死亡数，定常人口，余命などの生命関数を用いて表現する．コホートまたは世代生命表はほぼ同じ時に生まれた個人のグループまたは群の実際の生存の出来事を表わす［5］．

　(2) サバイバル分析
　相対危険度RRを用い，各期間に生存している確率とその生存に影響を与えると仮定された因子との関連を研究する方法で，生命表を発展させた分析方法である．統計分析方法では，比例ハザード（罹患率）モデルをよく使う．基本的手法は重回帰分析やロジステックモデルと同じであるが，重回帰では連続変数，ロジステックモデルでは割合がそれぞれ従属変数である一方，比例ハザードモデルでは時間経過を分母とする罹患率が従属変数となる．

　(3) Kaplan-Meier法
　生存率の計算に有効で少数例に応用できる．観察期間がイベント（死亡，発病など）によって決定されるので，恣意的ではない．観察打ち切り例を含むすべての観察対象者の情報を利用でき，計算が簡単で，コンピュータなしでも計算可能である．ただし，正確な観察開始からの期間の情報が必要で，観察期間の後半に発生するイベントに重みがあり，結果が影響を受けることがある［10］．

　 (4) 動物年法
　動物と時間を結びつけた測定単位で，簡単な発生率の分子として用いられる［5］．たとえば，ある農家に3頭の牛がいて，1年間のあいだに2頭が何かの疾病に罹患したとする．最初の1頭は120日（0.33年）で2頭目が240日（0.67年）の場合，2/（1＋0.33＋0.67）＝2/2＝1で，この農家での1年間の発生率は1牛年となる．この数値を使えば，伝播スピードに関して他の農家との比較が可能になるし，家畜の出入り（売買）が激しい農家における発生率の数量化には特に役立つ．

　 2．BSE関連の疫学研究事例紹介

　事例1．英国におけるBSE発生に関する疫学研究

　初期の調査で200頭の患畜について詳細にわかる疫学データを収集した．患畜の間の共通の因子を観察すると，濃厚飼料に含まれる動物由来の蛋白であるらしいことがわかったが，これだけでは因果関係を証明できない．よって，本来であればコホート研究を実施し，疑いのもたれた濃厚飼料を摂取する牛群と摂取しない牛群を数年観察し，摂取した牛群のほうにBSEが多く発生すれば，この飼料が原因であるということが結論できる．しかし，実際には，飼料会社側の問題で同じ飼料が手に入らなかったため，飼料が原因であることを証明するためのコホート研究は実施されなかった［4］．
　そこで，BSE患畜が出た農家群（患畜群）と出ていない農家群（対照群）を設定し，2つのグループの危険因子の割合を比較し，因果関係を検討する手法である患畜対照研究を実施した．農家対照群の選択では，患畜が出た農家と飼育・繁殖方法が似ているか，飼育記録があるか，獣医師が定期的に訪問しているか，成牛は同じ農家内で交配されたのか，などの条件にも当てはまる農家が対照として選ばれた［4］．この分析結果により，肉骨粉入りの飼料がBSEを発生させた共通の媒介物質という推定がもっともらしいという結論が得られ，1988年7月に肉骨粉の使用が禁止された．
　このように，コホート研究だけが原因究明に役立つ手法ではないことがわかる．問題は，かぎられた情報内でどのような研究調査が可能かを緊急に判断し実施することである．コホート研究は理論上では因果関係調査には適しているが実施が難しいため，最近では，患畜対照研究のほうが実用的で優れているとの意見もある［10］．
　いっぽう，伝播機構の研究ではコホート研究が使われた．母子感染を調査するためである．これは1989年7月より始まり，患畜の出た農家，約300軒より1農家あたり，1組から複数のペア（このペアとは患畜を母牛とする子牛Aと6歳以上の健康な母牛より産まれた子牛Bの2頭のことで，BはAと同じ季節に産まれている）を購入した．そして，平均潜伏期間5年間を過ぎた7歳になるまで経過を追って，どの程度のBSEが発生するかを調べた．もし，途中でBの母牛がBSEに罹れば，この子牛ペア（AとB）は研究より取り除かれた．そして，1997年1月までにすべての脳サンプルが検査された．1997年4月に出された中間報告によれば，リスクは10％以下であるが，直接の母子感染の可能性，または汚染餌に対する感受性に遺伝性の背景が加わっている可能性もあると説明された［4］．その後の研究によると，BSEは母子感染というより，BSEに感染しやすいという個体の遺伝的な素質のほうが感染に関連しているとの見解が出されている［3］．

　 　事例2：英国の誕生コホートとBSE感染についての研究

　比例ハザードモデルを使用し，1985年から1997年までの誕生コホートとBSE感染の関係を研究した［7］．これによると1987年に生まれた牛が，一番BSEに罹るリスクが高く，1985年6月30日以前に生まれた牛より22.5倍もBSEに罹りやすいことがわかった．しかし，1988年7月以降，つまり，肉骨粉の使用が禁止されてから生まれた牛では，7.39倍とリスクは低くなっている．また，この分析によりBSEが大規模な酪農家の問題であることも判明した．全国レベルでの統計分析はこれが初めてであり，1988年の肉骨粉使用禁止後，最初の12カ月間に生まれた牛の，BSEに感染するという危険が，67％減少したことも明らかになった．

　 　事例3：スイスにおけるBSEサーベイランスに関する研究

　スイスでは，最初のBSEケースが1990年11月に確定診断された．その後は，受動的サーベイランス・システムにより，臨床症状が現われた症例のみ組織学的検査が実施されていたが，このサーベイランスがどれほど効果があるのかはよくわからなかった．そこで，全頭ではないが，何らかの理由で死亡したり廃棄処分された24カ月齢以上の牛を対象に能動的なターゲット・サーベイランス・システムを開始した［2］．1992年から1999年の間に，年平均で臨床症状からBSEと疑われ報告された牛は81頭，その内43％がBSEであると確定診断された．1999年5月と2000年4月の間に，臨床症状から30頭が受動的サーベイランス（検査数104頭）で，20頭がターゲット・サーベイランス・システム（検査数11,376頭）で発見された．サーベイランス・システムの違いによるオッズ比は53で，受動的サーベイランスよりターゲット・サーベイランスを実施することにより，53倍もBSE感染牛を発見しやすくなることが観察された．この結果より，BSE汚染状況をより正確に推定するためには，両方のタイプのサーベイランスを組み合わせる戦略が有効であると報告している．

　 　事例4：英国におけるBSEに関する前向き研究

　1997年から5年間の計画で実施されている前向き研究がある［1］．BSE有病率は低いがBSE発生のあった純血肉用アンガス牛の1群を対象に，死亡までの行方を個体レベルで追って，脳，リンパ系組織と筋肉を収集検査し，BSE不顕性感染の有病率を推定している．この研究を実施することにより，生涯コホートスキーム，政府機関の機能の仕組み，農民のプログラムへの賛同と協力の程度，長期間にわたる調査実施にかかる難しさについて記録することが目的であった．中間地点である1999年10月までに，75％（506/673）の調査対象牛が生存し，そのうち42％は研究対象として農家に残っていて，33％が英国中の他の農家に分散していた．死亡した牛77％からサンプルが収集できたが，脳組織はすべて陰性で，BSEに感染した牛は報告されていない．この研究により，全国レベルでも前向き調査は可能であるということがわかった．しかし，少数の農民ではあったが，研究への協力が得られなくて，77％しかサンプル採取ができず，BSE研究には不完全なデータとなった．著者らは，農民など研究調査対象者や研究協力者との十分な相互理解が，前向き研究には必須であることを強調していた．

　 3．日本でも実施可能なBSE関連疫学・コホート研究

　本稿では，コホート研究について，その特徴と応用方法（事例）について述べてきたが，コホート研究を実施する以前に実施すべき調査項目がある．それは，患畜対照研究である．患畜に共通する因子を調査するだけではなく，上記の英国の事例のように患畜対照研究を実施し，BSEに罹った牛（群）と健康な牛（群）において，さまざまな因子の分布を比較し，因果関係を研究することが重要である．患畜対照研究で疑わしきリスク因子を洗い出し，その結果にもとづき横断研究を計画し，日本全土の牛全体に及ぼすリスクを推定することが急がれている．そして，絞り込んだ因子が実際にBSE発生と関連するのか，実施可能であれば，コホート研究を使い証明すべきであろう．
　現在，代用乳が共通の感染源であるらしいとの報道がなされているが，患畜対照研究の結果を得る前に感染源をひとつに絞りこむことには問題がある．たとえば，メーカーがそれぞれ違うという理由から，代用乳より肉骨粉混入の可能性の高い人工乳は感染源としては検討されていないし，国産肉骨粉にも汚染の可能性があるとも考えるべきであろう［9］．
　このような理由と上記の事例から，今後のBSE対策には疫学研究の導入は必須であろう．紙面の都合上から，詳細については記述できないが，以下のような疫学研究の実施を提案する．また，実施にあたり，農家の協力を全面的に得られるための体制づくりが重要であることは，上記事例にも記載されているとおりである．
〔疫学研究実施についての提案〕
1) 患畜が出た農家と患畜が出ていない農家（対照）を対象とした患畜対照研究の実施．
2) BSEと診断された牛と同じ期間に生まれた牛コホートの追跡調査：全国レベル，農家・群れレベル（管理・飼育方法など），個体レベルでの調査．
3) と畜場で全頭検査された個体を対象とする後ろ向きコホート研究．
4) 耳番号（耳標）による，前向きコホート研究とデータベースの作成（調査対象となる関連因子の選別）．
5) 4）を利用したサーベイランス・システム評価のための，データ収集と分析．

　 お　わ　り　に

　牛肉の安全性に対する消費者の信頼を取り戻すために，政府，生産者，流通業者によりさまざまな取り組みが行われてきた．牛肉の消費も徐々に増えてきているが，一部の消費者はいまだ不安感を持っている．というのも，日本でのBSE発生に関する因果関係に関する研究結果や調査方法などが一般市民へは届いていないからである．まずは，海外での経験や研究成果を確実に消化することが重要である．それから，日本独自の食の安全対策を進めていくうえでは，疫学的調査研究をルーチン化し，生産者，消費者，政府などが同じ土俵で同じ言葉を使い情報交換が自由にできるようになることが，今一番求められていると思う．そのためにも，疫学研究の導入が有効であり，安全な食を求めて国民全体が協働できる体制を築く重要な架け橋となるであろう．

引　用　文　献
[1] Carson C, McKay JS, Brooks HW, Kelly DF,
Stidworthy MF, Wibbelt G, Morgan KL : Establishment and maintenance of a longitudinal study of bovine spongiform encephalopathy (the ULiSES scheme), Prev Vet Med, 51, 245-257 (2001)
[2] Doherr MG, Heim D, Fatzer R, Cohen CH,
Vandevelde M, Zurbriggen A : Targeted screening of high-risk cattle populations for BSE to augment mandatory reporting of clinical suspects, Prev Vet Med, 51, 3-16 (2001)
[3] Ferguson, NM, Donnelly CA, Woolhouse MEJ, Anderson RM : A genetic interpretation of heightened risk of BSE in offspring of affected dams, Proceedings of the Royal Society of London―Series B, Biological Sciences, 264 (1387), 1445-1455 (1997)
[4] 門平睦代：日獣会誌，50，564-567（1997）
[5] 重松逸造，春日　斉，柳川　洋監訳：疫学辞典，(財) 日本公衆衛生協会，東京（1987）
[6] Spongiform encephalopathy advisory committee, Report of the epidemiology sub-committee on BSE maternal transmission, April 11 (1997)
[7] Stevenson MA, Wilesmith JW, Ryan JBM, Morris RS, JW Lockhart, Lin D, Jackson R : Temporal aspects of the epidemic of bovine spongiform encephalopathy in Great Britain, individual animal-associated risk factors for the disease, Veterinary Record, 147 (13), 349-354 (2000)
[8] Woodward M : Epidemiology, Study design and data analysis, Chapman & Hall/CRC, Florida, pp 191-241 (1999)
[9] 山内一也：全酪新報，8月20日号（2002）
[10] 柳川　洋ら編集：疫学マニュアル，南山堂，東京（2002）